—20℃）凍存——應選較佳稀度凍存。③若工作濃度大于1∶500則要先將原液稀釋十倍，而后分裝10μl/瓶→凍存（-20℃）于冰箱備用。④關于Ab保存應參照說明書。（3）Ab濃度的選擇Ab濃度不可太高或太低，因為Ag-Ab結合需在一定濃度范圍內進行，若一方過剩則形成復合物小且少；極過剩時已形成的復合物亦會解體而呈現(xiàn)假陰性?！⒎茿b濃度越高越好。3．Ab滴片技術——所滴的抗體應與切片上的組織剛好吻合。[注意]滴抗體前需把切片上的水弄干，但不能干片。要領：甩凈組織周圍的水。4．PBS洗滌技術（1）洗滌的目的①保證離子濃度和PH值。②減少非特異反應（平時Ab不可靠很純）（2）方法：洗三次，每次5分鐘。5．Ab孵育技術（1）必須在濕盒內進行，以防抗體的蒸發(fā)和干片。（2）溫度與時間4℃：過夜；37℃：2hor參考說明書6．光鏡控制顯色方法（1）室內操作：注意溫度與時間的關系，室溫較宜5分鐘。（2）染色稍淺亦可拿出，脫水，封片后顏色可加深。對照組和染色結果的評價從以下幾個方面綜合評價：1．陽性染色特點①Ag定位，胞漿、胞核、胞膜、間質具有結構性。（非特異性～細胞與組織無區(qū)別）②染色強度不同：顏色深淺不一。如果要做免疫組化找融享生物。江蘇組織免疫組化檢測哪里有

酶消化法 常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶，應嚴格掌握好消化時間、溫度和濃度。胰蛋白酶使用濃度為0.05%～0.1%，消化溫度為37℃，消化時間為10～40**要用于細胞內抗原的顯示:胃蛋白酶使用濃度為0.4%，消化溫度為37℃，消化時間為30～180要用于細胞間質抗原的顯示，如:Laminin（層粘蛋白），Collagen IV（IV型膠原蛋白）等。熱修復法 現(xiàn)常用微波修復、高溫高壓修復、水浴加熱修復法。較常用的修復法是pH6.0枸櫞酸緩沖液。修復過程中的注意要點是:（1）達到規(guī)定的溫度（92℃～95℃以上）;（2）維持一定的時間，微波修復、水浴加熱須控制在10～15min，高溫高壓修復須控制在2min左右;（3）避免切片干涸，如果切片干涸，抗原則可能完全丟失;（4）加熱后必須經過室溫自然冷卻20～30min，使未折疊的蛋白分子鏈恢復天然構型。江蘇IHC免疫組化染色融享生物為您提供一個專業(yè)的技術服務，吊炸天的免疫組化。

標本

實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。

其中石蠟切片是制作組織標本比較好常用、比較好基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中優(yōu)先的組織標本制作方法?？贵w

免疫組化實驗中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體，單克隆抗體是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，應用細胞融合雜交瘤技術免疫動物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產生的抗體混合物。

拍照

有條件的話比較好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序;應在暗室中進行檢查;防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡;檢查時間每次以1~2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱;標本受紫外線照射3~5min后，熒光也明顯減弱或褪色;激發(fā)光長時間的照射，會發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象;所以較多不得超過2~3h;熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再啟用時，須待燈光充分冷卻后才能點燃。天中應避免數(shù)次點燃光源。關閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后;標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā);使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發(fā)熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油;電源比較好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不只會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。

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    5．滴加抗體，4℃過液或室溫5′~1hour。6．，洗三次，每次5分鐘。7．滴加第二抗體，室溫15′~60′。8．洗凈，洗三次，每次5分鐘。9．滴加ABC復合物，室溫15~60分鐘。10．洗三次，每次5分鐘。11．Tris–HCL5~10分鐘，此步可省略。12．DAB—H2O2顯色：用，室溫5~30分鐘，隨時鏡檢（DAB用時新配）13．自來水洗凈。14．用Mayer蘇木素或甲基綠，復染胞核（可不染）。15．常規(guī)脫水、透明、封固、鏡檢。結果：棕褐色反應產物**抗原X的定位。免疫組化染色基本技術及注意事項1．實驗計劃①根據(jù)課題的內容選用動物，選用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗體，與其他種屬間無交叉，則不能用其他動物，而且Ab-Ⅱ必須是羊抗鼠，若***法Ab-Ⅲ必須來源于鼠，否則不能連接成復合物。②若要比較染色深淺在對照組與實驗組間的差異，在貼片方面較好貼于同一張載片上，否則無可比性。③選用的試劑可靠，貨源充足，隨時可取。2．Ab稀釋度（如系購買的藥盒有工作液和原液）（1）工作液：無須稀釋（2）原液：①應參照其提供的工作液濃度進行預試驗驗。如：工作液濃度為1∶1000，可選1∶500，1∶1000，1∶1500試驗；若:1∶500有背景，1∶1000陽性反應稍淺，可選1∶750進行試驗。②原液的保存。免疫組化服務找融享。山東免疫組化染色

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經驗總結編輯

做過病理實驗的人都知道，實驗看似容易，但真想把它做好，還是需要花上很長一段時間去積累和摸索經驗。我從事病理實驗已有6年多了，在這段時間里，我做過許許多多病理相關實驗，剛開始啥也不懂，一味按照網上操作流程來做，但做的結果往往并不是十分理想，較好終結果未能達到預期的效果。經過一段時間的瀏覽和學習，從一些在論壇內學習、請教，并結合實踐操作，我經歷了初級——查找資料和摸索方法；中級——問題求助和不斷總結；高級——難題解答和經驗分享這三個階段，也學到了不少知識，積累了很多寶貴經驗，與大家一起分享下。

關于掉片

HE、Masson、番紅O、Nissl、Mallory等染色方法很少有掉片現(xiàn)象；免疫組化和細胞凋亡檢測我們采用專門購買的防脫片，由于整個實驗流程比較長，在實驗過程中產生掉片是很正常的現(xiàn)象。對于容易掉片的組織，如：骨組織、腦組織、皮膚組織等掉片有時候是不可避免的。

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