聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于放大擴增特定的DN段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是“微量證據”的威力之所在。發(fā)明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。到2013年，PCR已發(fā)展到第三代技術。Real-time PCR反是一項利用DNA雙鏈復制的原理。廈門骨頭Real-time PCR

內標在傳統(tǒng)定量中的作用，由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平臺期時，檢測重現性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標后，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。內標對定量PCR的影響，若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為明顯。但由于待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。常州微量數字PCR服務聚合酶鏈反應的這種能力增強了許多方法，例如生成雜交探針用于雜交。

Real-time PCR：1.DNA或RNA的定量分析：Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉基因動植物轉基因拷貝數的檢測，RNAi基因失活率的檢測等；2.基因表達差異分析：例如比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學處理等)，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA晶片或差顯結果的確證；3.基因分型：例如SNP檢測，甲基化檢測等。Real-time PCR常用的兩種方法分別為Sybrgreen（螢光染料摻入法）和Taqmanprobe（探針法）。

Real-time PCR雙熒光標記探針設計原則：具體的其他要求可以具體聯(lián)系設計公司，拿到合成好的引物，需要先確認引物的性能。可以用這對引物先擴增梯度稀釋后的標準品（標準品介紹見后續(xù)內容）。由不同梯度標準品的加量和其對應的Ct值，描繪出一條標準曲線。這里要注意根據標準曲線得到的參數是非常重要的。引物性能確認：1.決定系數R2大于0.98，越接近于1，結果越可靠。2.擴增效率一般要求在0.8-1.2，越接近于1，越好。3.檢測的靈敏度，必須確認，通常要求35個循環(huán)以內，一般可以得到比較好的定量結果，30個循環(huán)以內，沒有非特異性擴增產生。4.NTC是必須要確認的，通常要求30個循環(huán)內沒有引物二聚體產生。Real-time PCR探針法實驗結果穩(wěn)定重複性好，特異性更高。

Real-time PCR相對定量中的標準曲線法如何進行：主要是相對定量標準品的制作，一般有三種方法：1、比較復雜的方法：質粒，采用Biotnt提供內參基因的特異性Real-time PCRmRNA引物，對目的基因進行Real-time PCR實驗，得到PCR擴增產物；PCR擴增產物轉入質粒中，得到相對定量的標準品；2、一般采用的方法1：比較強的CDNA模板，3、一般采用的方法：PCR擴增產物，如果在方法2中找不到比較強的CDNA模板，則選用PCR產物作為相對定量的標準品也是可以的；需要注意的事項是：PCR產物濃度很高，而Real-time PCR的產物片段比較短，容易在稀釋的過程中造成PCR污染，要注意操作。Real-time PCR探針法具有高適應性和可靠性。常州微量數字PCR服務

Real-time PCR技術已經被普遍用于監(jiān)測細胞mRNA表達量的變化。廈門骨頭Real-time PCR

聚合酶鏈式反應又稱多聚酶鏈式反應，是一項利用DNA雙鏈復制的原理，在生物體外復制特定DN段的核酸合成技術。透過這項技術，可在短時間內大量擴增目的基因，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應是是一種簡單，廉價和可靠的方法復制DN段，這個概念適用于現物學和相關科學的許多領域。PCR可能是分子生物學中使用很較廣的技術。這種技術被用于生物醫(yī)學研究，犯罪取證和分子考古學。通常，PCR由一系列20-40次重復的溫度變化組成，稱為熱循環(huán)，每個循環(huán)通常由兩個或三個離散的溫度步驟組成。聚合酶鏈式反應準備：引物內部不應出現互補序列。廈門骨頭Real-time PCR

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