無縫克隆的原理：在載體末端和引物末端應具有15-25個同源堿基（同源臂）。通過T5核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶，三種酶同時發(fā)揮功能，從而達到單片段或多片段與載體連接的技術。T5核酸外切酶：5‘→3’端消化DNA片段，形成粘性末端；DNA聚合酶：填補缺口；DNA連接酶：兩條DNA單鏈黏合起來。無縫克隆的特點傳統(tǒng)分子克隆無縫克隆傳統(tǒng)分子克隆和無縫克隆對比：單次插入片段：傳統(tǒng)分子克隆一輪只能插入一個片段；無縫克隆單個至多個（≤5）。受限于酶切位點：傳統(tǒng)分子克隆是；無縫克隆不是。引入多余序列：傳統(tǒng)分子克隆是；無縫克隆不是。流程&操作時間：傳統(tǒng)分子克隆流程繁瑣，時間長。無縫克隆流程簡單，時間短。克隆效率：傳統(tǒng)分子克隆較低；無縫克隆單片段≥95%。實驗流程1.載體制備載體的線性化：酶切（單酶切、雙酶切）或反向PCR擴增。①酶切制備使用限制性內切酶進行載體線性化時，推薦使用雙酶切方法進行，其次是單酶切。注意:1：經(jīng)雙酶切進行線性化的載體無需去磷酸化，經(jīng)單酶切則需要去磷酸化；2：酶切完成后，應將快速內切酶失活或將目的產(chǎn)物進行純化后再用于重組反應。②反向PCR擴增制備載體末端引物設計：反向PCR擴增制備線性化載體需要使用的引物。臨床上平時不易見到的疾病可用動物隨時復制出來。鎮(zhèn)江疾病動物模型建模原理

實驗動物年齡：成年5、實驗動物體重：160-200g6、實驗動物環(huán)境：SPF級1、實驗方法：熱力致皮膚損傷法。麻醉大鼠，根據(jù)體重腹部備皮，然后固定于實驗臺上。將大鼠移近加熱純凈水的燒杯，將紗布條浸入熱水中，待水溫恒定于99℃時，取出紗布，立即平鋪于待燙部位，于紗布接觸大鼠皮膚后開始計時。致傷3s為淺II°燙傷，致傷10s為深II°燙傷。2、檢測標準：a.皮膚大體觀察：致傷3s大鼠局部皮膚發(fā)紅、輕微水腫。愈合后毛發(fā)生長良好，有少量紅褐**素沉著，皮膚輕微攣縮，表皮光滑；致傷10s大鼠局部皮膚發(fā)白、水腫。愈合后毛發(fā)生長良好，皮膚瘢痕形成，表面粗糙不平。鎮(zhèn)江疾病動物模型建模原理確定研究疾病目的了解影響疾病發(fā)生的內在與外在因素。

《人類疾病動物模型》為生部"十一五"規(guī)劃教材。為了提高醫(yī)學研究生培養(yǎng)質量，編寫一套供全國高等醫(yī)學院校研究生用規(guī)劃教材，全國高等醫(yī)藥教材建設研究會、衛(wèi)生部教材辦公室組織在全國進行了主編人評選，授主要介紹人類疾病動物模型總論、人類疾病動物模型各論等。在生命科學領域中，實驗研究是學科發(fā)展的基礎，尤其是動物實驗,是生命科學實驗研究中的重要組成部分。對實驗動物進行科學的繁育，以及實施嚴格的質量監(jiān)測和管理，其目的就是使動物實驗研究準確無誤而更接近真實，使實驗結果具有科學性和重復性。在動物實驗中人們發(fā)現(xiàn)，動物在生命活動中的生理和病理過程，與人類或異種動物都有很多相似之處，并可互為參照，一種動物的生命活動過程可以成為另一種動物乃至人類的參照物。

    缺點：該移植模型的原發(fā)出現(xiàn)與轉移發(fā)生之間時間間隔短，不利于藥物藥效研究;且細胞為鼠源，與人類有一定的差異。2異種移植模型異種移植模型是將人類的細胞或組織移植入免疫缺陷型實驗動物體內。此模型一般采用免疫缺陷型小鼠，例如無胸腺裸鼠、CB17-SCID小鼠、NOD/SCID小鼠、NSG小鼠。一般來說，免疫缺陷程度越高，成瘤性越好。的相關研究中，人源細胞系異種移植(cell-line-derivedxenograft，CDX)模型和患者組織異種移植(patient-derivedxenograft，PDX)模型已得到廣泛應用。CDX模型方法：將5×106的人A375黑色素瘤細胞皮下注射NOD/SCID小鼠腹側的雙側，成功構建黑色素瘤CDX模型。PDX模型方法：有研究者將93個新鮮的患者組織切成2×2×2mm3碎片的大小，皮下接種6周大的NOD/SCID雌性小鼠，建立PDX模型。優(yōu)點：保留了病人的組織學和遺傳學特征，可模擬潰瘍狀態(tài)對人類黑色素瘤預后的影響。缺點：此模型移植后的潛伏期長，連續(xù)傳代后鼠基質被人類基質替代，移植率可變，免疫系統(tǒng)受損，有移植物抗宿主病的可能性以及某些免疫細胞功能的缺乏。三、轉基因小鼠模型可以通過異位表達基因，引入特定的致突變或滅活抑制基因來對小鼠進行轉基因黑色素瘤模型的構建。必須真正了解研究者感興趣且需要的小鼠疾病模型。

即為本發(fā)明構建的一種pirb基因敲入的小鼠動物模型。本發(fā)明所采用第二種技術方案的特點還在于，步驟1中得到grna1和grna2后分別與trancrrna在25℃孵育10min形成二級結構。步驟3中grna1、grna2的濃度均為2～10pmol/ul，cas9蛋白的注射濃度為30～100ng/μl。步驟4中southern雜交采用bamhi和avrii核酸內切酶切割f1代雜合子小鼠的dna。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了pirb基因敲入的小鼠動物模型及其構建方法，本發(fā)明的小鼠動物模型對于pirb基因功能的研究和在體驗證提供了良好的基礎。分離自pirb基因敲入小鼠的細胞還可以用于研究pirb發(fā)揮調節(jié)作用的下游機制。能夠準確模擬人相關特定功能與疾病特征。鹽城Balbc裸鼠疾病動物模型建模

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pirb在軸突生長錐表達，位于富含肌動蛋白的前緣和synapsin免疫陽性的囊泡中，在神經(jīng)元突起的表達呈點狀分布。文獻表明，pirb表達隨年齡增加，特別是在老齡認知損傷的小鼠海馬中，pirb能夠抑制軸突再生和突觸可塑性。研究表明小鼠aβ寡聚體對海馬長時程增強的破壞作用需要pirb的參與，在ad轉基因模型中，pirb不僅參與成年小鼠記憶缺失，而且介導幼年小鼠視皮層突觸可塑性的丟失。這些研究提示我們，pirb參與突觸可塑性，抑制pirb可能對ad起到效應。鎮(zhèn)江疾病動物模型建模原理