1、樣本采集：

1）.采集方式：不同的方式（手動或電刺激）收集的乳汁會影響其脂肪的含量，皮膚對樣本的污染程度也不同。

2). 采集部位：乳房的前后部產(chǎn)生的乳汁成分有一定差異，一般采集相同體積后混合，或者從全乳收集。

3). 樣本保存：低溫保存。不可冰凍或常溫、高溫保存。不同的保存容器（玻璃、聚乙烯、聚丙烯等）會通過影響細(xì)胞含量而影響外泌體的含量。

2、注意事項

要注意選擇對照組，因為有很多因素可以影響乳汁中外泌體的成分，其中包括泌乳階段、乳汁產(chǎn)量、嬰兒哺乳、飲食、代謝狀態(tài)、生理與心理狀態(tài)等。例如初乳（1-5天）、過渡乳（6-15天）和成熟乳中蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和抗體的濃度相差很大。 云生物專業(yè)外泌體服務(wù)。山東數(shù)據(jù)庫外泌體銷售

    Nature：從血液通過exosomes入手早期確診**。原文標(biāo)題：Glypican-1identifiescancerexosomesanddetectsearlypancreaticcancer。原文摘要：Exosomes are lipid-bilayer-enclosed extracellular vesicles that contain proteins and nucleic acids. They are secreted by all cells and circulate in the blood. Specific detection and isolation of cancer-cell-derived exosomes in the circulation is currently lacking. Using mass spectrometry analyses, we identify a cell surface proteoglycan, glypican-1 (GPC1), specifically enriched on cancer-cell-derived exosomes. GPC1+ circulating exosomes (crExos) were monitored and isolated using flow cytometry from the serum of patients and mice with cancer. GPC1+ crExos were detected in the serum of patients with pancreatic cancer with absolute specificity and sensitivity, distinguishing healthy subjects and patients with a benign pancreatic disease from patients with early- and late-stage pancreatic cancer. Levels of GPC1+ crExos correlate with tumour burden and the survival of pre- and post-surgical patients. 山東數(shù)據(jù)庫外泌體銷售外泌體全轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒炘趺捶治觯?/p>

⊙外泌體的大?。和饷隗w的直徑約40-150nm

⊙從研究上來講并不太嚴(yán)格區(qū)分外泌體（exosomes）或微泡（microvesicles）

⊙外泌體屬于胞外囊泡類，除了外泌體之外細(xì)胞還分泌微泡以及其它的膜囊泡

⊙外泌體的直接比微泡的要小，后者直徑為100nm-1μm

⊙外泌體的數(shù)量：人體中大約有1014個，近乎于平均每個細(xì)胞產(chǎn)生1000-10000個

⊙外泌體的細(xì)胞源：人體中幾乎所有類型的細(xì)胞均能產(chǎn)生外泌體

⊙外泌體具有異質(zhì)性，即使是同一種細(xì)胞分泌的外泌體都有可能具有很大功能區(qū)別

⊙外泌體的存在：外泌體幾乎存在于所有的組織、細(xì)胞間隙、體液中

⊙外泌體產(chǎn)生于細(xì)胞中的多泡體

    體液樣本收集外泌體。抽血技巧：操作要輕柔迅速。試管可翻轉(zhuǎn)8-10次使樣本與抗凝劑混勻，避免劇烈搖晃?；靹蚝?，將試管固定垂直放置于離心分離器，在頂部記錄抽血的準(zhǔn)確時間，因為抽血與離心之間的時間間隔可能是一個影響因素。外泌體在抽血后30分鐘內(nèi)是比較穩(wěn)定的，若時間過長將導(dǎo)致外泌體數(shù)量增加。血小板極易因抽血時的物理因素而***并釋放出外泌體，其中包括接觸、壓力、切力。抽血時間：除了血液黏度，體內(nèi)血液的各項指標(biāo)在***中變化很大。生理節(jié)律會對血小板的***產(chǎn)生很大的影響。白細(xì)胞的募集和循環(huán)系統(tǒng)中促炎細(xì)胞和***細(xì)胞會隨時間變化。大量的具有特殊表面分子的微粒也被證明會隨時間變化。目前尚無設(shè)計較好的實驗對證實不同時間血液中外泌體的變化，故應(yīng)在相同的時間采集樣本。目前飲食是否會對EV產(chǎn)生影響尚未可知，但是由于脂蛋白可運載RNA且食物的攝取可以影響循環(huán)脂蛋白顆粒的類型、數(shù)量和作用，故抽血可在***一次用餐后一段確定的時間進(jìn)行。 外泌體全轉(zhuǎn)錄組測序高級分析包括哪些？

細(xì)胞上清（需采用去除外泌體的培養(yǎng)基）：

(1) 細(xì)胞在正常含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時間，貼壁細(xì)胞密度在70 %-80 %，懸浮細(xì)胞密度在60 %-70 %；

(2) 對于貼壁細(xì)胞，去除原有培養(yǎng)基，換為新的不含外泌體的培養(yǎng)基或者無血清培養(yǎng)基；對于懸浮細(xì)胞，300 g，4°C，10 min收集細(xì)胞；

(3) 使用不含外泌體的培養(yǎng)基或者無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24-48 小時，根據(jù)細(xì)胞的生長速度確定收取上清時間；

(4) 收集細(xì)胞上清，300 g，4°C，離心10 min；小心吸取上清，注意避免吸入細(xì)胞或者細(xì)胞碎片；

(5)   3000 g，4°C，再次離心15 min，確保將細(xì)胞或者細(xì)胞碎片去除干凈；

(6) 取上清，注意避免吸入細(xì)胞或者細(xì)胞碎片，合并相同的細(xì)胞培養(yǎng)液上清樣品，裝入無菌的玻璃瓶，可在4°C短期保存（1-2天），長期保存可凍存于-80°C 。建議細(xì)胞上清分離后盡快進(jìn)行外泌體分離，保存在4°C和-80°C，都會對產(chǎn)量有一定的影響。

云生物就帶您了解一下外泌體的特點。山東數(shù)據(jù)庫外泌體銷售

⊙外泌體發(fā)揮功能并一定需要受體細(xì)胞攝入外泌體：外泌體的膜蛋白有可能與細(xì)胞膜蛋白作用，***細(xì)胞內(nèi)通路

⊙外泌體的角色之一：細(xì)胞-細(xì)胞通訊，比如抗原遞呈

⊙外泌體的角色之二：垃圾箱，外排多余或者無功能的細(xì)胞成分

為什么要研究外泌體？：

⊙揭示疾病發(fā)病機制：從微環(huán)境角度揭示細(xì)胞之間通訊促進(jìn)疾病發(fā)生的原因。

⊙尋找疾病診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物

⊙外泌體作為藥物載體，實現(xiàn)靶向給藥

外泌體的分離和鑒定方法：

⊙外泌體的分離：差速離心、密度梯度離心、體積排阻色譜法、過濾法、聚合物沉淀法、免疫分離、隔離篩選法

⊙外泌體分離后需要進(jìn)行粒徑分析：如NanoSight NS300

⊙外泌體檢測的marker：常用的有TSG101、CD9、CD63、CD81、ALIX、HSP70

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