Hepatic

stellate cell transdifferentiation involves genome-wide remodeling of the DNA

methylation landscape. J Hepatol. 2016;64(3):661-73. (IF= 14.911)

肝星狀細(xì)胞(HSC)是導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵細(xì)胞類型。DNA羥甲基化與轉(zhuǎn)錄***有關(guān)，其模式在人類疾病中經(jīng)常發(fā)生改變。研究者采用簡(jiǎn)化基因組氧化-亞硫酸鹽測(cè)序(RRBS/oxRRBS)檢測(cè)靜止和******狀態(tài)的大鼠HSC細(xì)胞的5mC和5hmC水平，證實(shí)了5mC和5hmC在肝纖維化和HSC轉(zhuǎn)分化過(guò)程中的整體變化，表明DNA甲基化/羥甲基化是HSC***的關(guān)鍵步驟，可能會(huì)為支持纖維生成的分子事件帶來(lái)新的見解，并可能為疾病進(jìn)展提供生物標(biāo)志物以及潛在的新藥物靶點(diǎn)。 DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)調(diào)控起著動(dòng)態(tài)的重要作用。廣東RIP-seq技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗(yàn)豐富

    隨著二代測(cè)序技術(shù)的告訴發(fā)展，測(cè)序成本大幅度下降，使得真正實(shí)現(xiàn)全基因組甲基化分析的研究成為可能。隨著人類甲基化圖譜繪制成功，已經(jīng)陸續(xù)有多個(gè)物種的甲基化圖譜構(gòu)建完成。研究者將傳統(tǒng)的DNA甲基化檢測(cè)方法，如亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化與高通量測(cè)序相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)單堿基精度的甲基化圖譜的構(gòu)建。此外將成熟的MeDIP技術(shù)與二代測(cè)序相結(jié)合，可以快速有效地尋找基因組上的甲基化區(qū)域，從而比較不同細(xì)胞、組織、甚至疾病樣本間的DNA甲基化修飾模式的差異。因此該技術(shù)也特別適用于大樣本量的疾病表觀研究。第三代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，更是讓甲基化的直接測(cè)定成為可能。一年前，美國(guó)PacificBiosciences公司利用獨(dú)有的單分子實(shí)時(shí)(SMRT)測(cè)序技術(shù)，直接測(cè)定了DNA的甲基化。這項(xiàng)成果發(fā)表在《NatureMethods》雜志上。 山東單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)服務(wù)甲基化驗(yàn)證是甲基化研究必不可少的一環(huán)。

    WGBS送樣要求一、送樣類型基因組DNA、細(xì)胞、全血、動(dòng)植物組織、FFPE二、保存方式1、基因組DNA、細(xì)胞、全血、動(dòng)植物組織：放-20℃冰箱中保存，或者放-80℃冰箱中長(zhǎng)期保存(1年以內(nèi))；保存期間避免反復(fù)凍融。2、FFPE樣本：室溫保存三、運(yùn)輸條件1、基因組DNA：冰袋或者干冰運(yùn)輸；2、細(xì)胞、全血、組織樣本：干冰運(yùn)輸，順豐陸運(yùn)（3-4天時(shí)間），夏季10-15公斤干冰；秋冬季10公斤干冰；3、FFPE樣本：室溫運(yùn)輸。四、樣本量要求1、基因組DNA：常規(guī)WGBS，不少于2ug；微量WGBS，20ng1）提供樣本DNA完整性質(zhì)檢結(jié)果，例如瓊脂糖凝膠電泳或者Agilent2100電泳等；2）提取基因組DNA，要加RNA酶，去除RNA污染；3）提取基因組DNA，溶到TE或者elutionbuffer,避免溶解到純水；樣本體積不超過(guò)100ul;4）提供Qubit檢測(cè)濃度，基于OD值的檢測(cè)方法，例如NanoDrop,會(huì)嚴(yán)重高估濃度。2、細(xì)胞樣本：常規(guī)WGBS，不少于5x10*6個(gè)細(xì)胞；微量WGBS，5000個(gè)細(xì)胞1）收集貼壁或者懸浮細(xì)胞、使用預(yù)冷的1×PBS，洗滌2次，600g離心5分鐘；2）***一次離心后，盡量去除上清PBS，保留細(xì)胞沉淀;3、全血樣本：2-5ml外周血使用普通EDTA抗凝管，避免使用肝素抗凝管。4、動(dòng)植物組織：動(dòng)物組織，30mg以上;植物組織，不同組織。

    cfDNA，cellfreeDNA，就是血液中游離的自身DNA，這些DNA多是從身體的細(xì)胞或者白血球破裂釋放出來(lái)的，基本上都是無(wú)害的，不用多久會(huì)被自身清理掉。不過(guò)值得一提的是，當(dāng)孕婦懷孕的時(shí)候，胎兒的DNA也會(huì)同時(shí)釋放到母親的血液里頭去，這是當(dāng)前火熱的無(wú)創(chuàng)唐氏篩查的基礎(chǔ)。通過(guò)抽取母親的外周血測(cè)序分析其中的游離DNA就可以判斷胎兒是否存在整個(gè)染色體或者大片段DNA的變異。有研究已經(jīng)證實(shí)，**患者外周血中的cfDNA總量，要高于健康人。通過(guò)這一點(diǎn)，雖然不能武斷的說(shuō)cfDNA能成為**標(biāo)志物，但是cfDNA的含量增多，能起到一個(gè)較好的提示作用，作為一個(gè)初篩的手段。基于cfDNA的液態(tài)活檢中，盡管ctDNA在**診斷中的應(yīng)用是當(dāng)下cfDNA*****，研究**深入的分支。但是，cfDNA作為液態(tài)活檢，不只是局限于**學(xué)。例如，有研究報(bào)道對(duì)于接受***移植手術(shù)的病人，可以通過(guò)監(jiān)測(cè)術(shù)后外周血中具有捐獻(xiàn)者基因特征，片段化的cfDNA含量變化，來(lái)評(píng)估移植***的排斥情況。 TBS具有高深度、定量、高準(zhǔn)確性 。

    cfDNABS-Seq送樣要求一、送樣類型分離好的血漿二、保存方式分離后的血漿，用ml離心管分裝，例如：1ml/管；放-20℃冰箱中保存（短暫保存，1-2周）；放-80℃冰箱中長(zhǎng)期保存(1年以內(nèi))；保存期間不能凍融。三、運(yùn)輸條件干冰運(yùn)輸：順豐陸運(yùn)（3-4天時(shí)間），夏季10-15公斤干冰；秋冬季10公斤干冰四、抽血要求1、使用Streck**管（不建議使用普通的EDTA-鈉抗凝管），采集10ml外周靜脈血（客戶沒(méi)有Streck**管，公司配送）；2、室溫或者放置4℃冰箱中半小時(shí)以上，不超過(guò)8小時(shí)，進(jìn)行血漿分離步驟五、血漿分離步驟1、4℃條件下以1600g離心10min，離心后將上清（血漿）分裝到2、4℃條件下以16000g離心10min去除殘余細(xì)胞，將上清移入新的離心管中，每管分裝1ml;3、血漿樣本存放于-80℃冰箱中保存;使用干冰運(yùn)輸,提取之前不能凍融。備注1：血漿分離在4℃條件進(jìn)行，如果客戶沒(méi)有冷凍離心機(jī)，也可以在室溫條件下進(jìn)行；備注2：離心后取血漿上清，避免吸取白細(xì)胞；通常10ml全血可以獲得4-5ml血漿。 焦磷酸測(cè)序技術(shù)服務(wù)基于QIAGEN公司的PyroMark Q96 ID平臺(tái)。上海RRBS技術(shù)服務(wù)共同合作

6mA在細(xì)菌、藻類及動(dòng)植物基因組中存在。廣東RIP-seq技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗(yàn)豐富

    焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）技術(shù)服務(wù)基于QIAGEN公司的PyroMarkQ96ID平臺(tái)，能提供基于序列測(cè)定的SNP檢測(cè)、等位基因頻率分析和甲基化檢測(cè)，雜合子缺失及細(xì)菌和病毒分型等技術(shù)服務(wù)。樣品要求·樣品類型細(xì)胞、新鮮組織或DNA樣品·樣品量細(xì)胞樣品請(qǐng)?zhí)峁┲辽?×106個(gè)細(xì)胞，組織樣品請(qǐng)?zhí)峁┲辽?00mg的組織塊或切片，DNA樣品請(qǐng)?zhí)峁?μg以上的DNA·樣品質(zhì)量基因組DNA無(wú)明顯降解，主帶清晰，大于23Kb，無(wú)明顯彌散。OD260/280值在～，濃度≥50ng/μl·樣品保存細(xì)胞樣品或新鮮組織塊（切成～50mg的小塊）可液氮凍存后，-80℃保存。DNA樣品可溶于乙醇或超純水中，-80℃保存。樣品保存期間避免反復(fù)凍融·樣品運(yùn)輸樣品置于ml凍存管中，封口膜封好，干冰運(yùn)輸。 廣東RIP-seq技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗(yàn)豐富