實時熒光定量 PCR 的數(shù)據(jù)分析

在指數(shù)增長期，PCR 產(chǎn)物量以指數(shù)形式增加，根據(jù)這一

原 則，假設(shè)擴(kuò)增效率為 E，模 板 起 始 量 為 N0，m 個 循 環(huán) 后

PCR 產(chǎn)物量為 Nm，則有 Nm=N0（1+E）m（1），對 該 等 式 兩邊 取

對數(shù)，則有 LgN0=-m·lg（1+E）+Lg Nm（2），若循環(huán)數(shù)達(dá)到某一

CT 值時，熒光閾值為 Q，式（1）可寫成：Q=N0（1+E）CT，式（2）

可 寫 成 ：LgN0=-CT·lg （1 +E） +LgQ。 當(dāng) 需 要 對 靶 基 因 在

mRNA 水平上進(jìn)行表達(dá)量分析時，通 常 采 用 式（1）進(jìn) 行 數(shù)

據(jù)分析。當(dāng)需要對靶基因拷貝數(shù)進(jìn)行Absolute Quantification時，則需要用

式（2）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 上海融享生物科技有限公司專業(yè)公司。江西相對定量qPCR公司

雙雜交探針也是 TaqM an 探針的衍 生形式,是由 Roche 公司開發(fā)的一種 PCR 定量技術(shù) (LightCy cler(r)實時熒光定量 PCR 系統(tǒng))。該技術(shù) 的特點是將熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分別標(biāo)記在發(fā)光探 針的 5' 端和淬滅探針的 3' 端兩個不同探針上 ,兩探 針可與模板同一條鏈相鄰的序列雜交, 雜交時兩探 針的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)便緊密相鄰(1 ～ 5 bp), 從 而發(fā)生 FRET 使熒光淬滅, 熒光淬滅的程度與起始 模板的量成反比, 以此可以進(jìn)行 PCR 定量分析 (Hardegg er 等 , 2000)。該方法的特點是淬滅效率 高,但由于 2 個探針結(jié)合在模板上 ,從而影響到擴(kuò)增 效率;另外 ,由于需要合成 2 個較長的探針, 合成成 本相對較高。江西相對定量qPCR公司上海融享生物科技有限公司專業(yè)致力于qPCR。

雖然在熒光定量 PCR 檢測時的過程比較 簡單，但是在前期樣本制備階段卻存在著很多影響因素，因此從 siRNA 序列的設(shè)計、質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染、細(xì)胞總 RNA 的提取、質(zhì)粒 DNA 的去除、cDNA 的獲得、試劑的 選擇及后續(xù)的操作步驟都應(yīng)優(yōu)化穩(wěn)定到比較好方案，方 能保證其結(jié)果的準(zhǔn)確性。實時熒光定量 PCR 技術(shù)在 mRNA 表達(dá)研究、基因組和病毒核酸的定量測定和等位基因的差異分析等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越***。通過本設(shè)計性實驗可以加深學(xué) 生對實時熒光定量 PCR 技術(shù)及其應(yīng)用的理解，為今后 的科研工作打下基礎(chǔ)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的各

項指標(biāo)：斜率、擴(kuò)增效率（E）、相關(guān)系數(shù)（R2

）、間距均需進(jìn)行

嚴(yán)格評價，從而確保該曲線的可用性。各點間距應(yīng)相等，間

距以及斜率的Absolute 值應(yīng)滿足 3.100~3.582，相關(guān)系數(shù) R2＞0.99，

擴(kuò)增效率（E）在 90%~110%之間。擴(kuò)增效率、斜率以及間距

三者相互關(guān)聯(lián)，擴(kuò)增效率（E）=10（-1/斜 率 ）

-1，斜率的Absolute值恰

是各點之間的平均間距。當(dāng)擴(kuò)增效率＜90%時，間距以及 斜

率的Absolute 值會＞3.582；當(dāng)擴(kuò)增效率＞110%時，間距以及斜率

的Absolute 值會＜3.10，故擴(kuò)增效率越低，斜率的Absolute 值越大，間

距越寬；擴(kuò)增效率越高，斜率的Absolute 值越小，間距越窄。擴(kuò)增

效率過低，酶的活性可能出現(xiàn)了問題，或反應(yīng)體系不適合反

應(yīng)的有效進(jìn)行。若擴(kuò)增效率過高，反應(yīng)管內(nèi)可能存在目的基

因擴(kuò)增之外的其他非特異擴(kuò)增，需要對引物進(jìn)行一個溶解

曲線的檢測，優(yōu)化反應(yīng)體系以及反應(yīng)程序。 您了解qPCR的優(yōu)勢嗎？

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。上海融享生物科技有限公司主營項目包括qPCR。江西相對定量qPCR公司

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研究 DNA 與能夠與之綁定、相互作用的化

合物（生物分子，如核酸、肽核酸、磷脂、蛋白

質(zhì)以及糖鏈等）之間的關(guān)聯(lián)性問題，對研發(fā)新的

生物制藥的中心作用靶點具有重要價值。Boger

等采取使用 RT-QPCR 技術(shù)探索多種生命分子與

核苷酸分子之間的相互影響的歸路來探尋***

**性疾病的新方向，并且認(rèn)為這是該技術(shù)的不

斷發(fā)展帶動著**相關(guān)性疾病的藥物***的研

究進(jìn)展，為之提供了研究工具和技術(shù)思路。

Lohman & Overman 等在報道了單鏈 DNA

結(jié)合蛋白（single-stranded DNA-binding proteins，

SSBs）后，人們逐漸認(rèn)識到這種分子是多數(shù)生命

體細(xì)胞生存時不可缺少的蛋白質(zhì)，它們成特定比

例地綁定到 DNA 單鏈結(jié)構(gòu)中，保護(hù) DNA 免受

部分損傷的同時，能否在遺傳時避免二級結(jié)構(gòu)的

形成，從而能夠確保完成正常的基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄

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