標(biāo)準(zhǔn)曲線的各

項指標(biāo)：斜率、擴(kuò)增效率（E）、相關(guān)系數(shù)（R2

）、間距均需進(jìn)行

嚴(yán)格評價，從而確保該曲線的可用性。各點間距應(yīng)相等，間

距以及斜率的Absolute 值應(yīng)滿足 3.100~3.582，相關(guān)系數(shù) R2＞0.99，

擴(kuò)增效率（E）在 90%~110%之間。擴(kuò)增效率、斜率以及間距

三者相互關(guān)聯(lián)，擴(kuò)增效率（E）=10（-1/斜 率 ）

-1，斜率的Absolute值恰

是各點之間的平均間距。當(dāng)擴(kuò)增效率＜90%時，間距以及 斜

率的Absolute 值會＞3.582；當(dāng)擴(kuò)增效率＞110%時，間距以及斜率

的Absolute 值會＜3.10，故擴(kuò)增效率越低，斜率的Absolute 值越大，間

距越寬；擴(kuò)增效率越高，斜率的Absolute 值越小，間距越窄。擴(kuò)增

效率過低，酶的活性可能出現(xiàn)了問題，或反應(yīng)體系不適合反

應(yīng)的有效進(jìn)行。若擴(kuò)增效率過高，反應(yīng)管內(nèi)可能存在目的基

因擴(kuò)增之外的其他非特異擴(kuò)增，需要對引物進(jìn)行一個溶解

曲線的檢測，優(yōu)化反應(yīng)體系以及反應(yīng)程序。 上海融享生物科技有限公司項目qPCR價格優(yōu)惠。上海SYBRGreen法qPCR哪里有

實時熒光定量 PCR(real-time quantitative

polymerase chain reaction，real-time Q-PCR)技術(shù)于

1996 年由美國 Applied Biosystems 公司推出，由于該

技術(shù)不僅實現(xiàn)了 PCR 從定性到定量的飛躍，而且與常

規(guī) PCR 相比，它具有特異性更強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性

好、定量準(zhǔn)確、自動化程度高、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點成為

分子生物學(xué)研究中的重要工具，目前已得到多應(yīng)用[1]。

實時熒光定量 PCR 的應(yīng)用范圍非常多，包括 mRNA

表達(dá)的研究、DNA 拷貝數(shù)的檢測、單核苷酸多態(tài)性的測

定等[2]。它能對結(jié)核分枝桿菌、乙型、丙型肝炎、愛滋

病、淋球菌、沙眼衣原體等病原體進(jìn)行準(zhǔn)確的定量

檢測。其定量范圍極寬，無需做梯度稀釋，特異性更強(qiáng)，

克服了假陽性。 上海SYBRGreen法qPCR哪里有一個好的qPCR項目需要具備哪些特點您了解嗎？

每個模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存 在線性關(guān)系 ,起始拷貝數(shù)越多 , Ct 值越小。利用已 知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線 ,因此 ,只 要獲得未知樣品的 C t 值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出 該樣品的起始拷貝數(shù)。SYBR GreenI 是一種能 結(jié)合到 dsDNA 小溝部位的具有綠色激發(fā)波長的染 料,它只有與 dsDNA 結(jié)合后才會發(fā)出熒光 。在變 性時 ,DNA 雙鏈分開 , 不產(chǎn)生熒光;在復(fù)性和延伸 時,形成 dsDNA , SYBR GreenI 發(fā)出熒光(宋敏等 , 2005 ;張晶等, 2005)。因此,熒光強(qiáng)度可以**擴(kuò)增 產(chǎn)物的數(shù)量。

該探針是長度為 20 ～ 24 bp 的寡核苷酸，在其 5' 末端標(biāo)記 1 個熒光報告基團(tuán)，3'末端標(biāo)記 1 個熒光淬 滅基團(tuán)，其序列與 2 個引物包含序列內(nèi)的 1 段 DNA 模板完全互補(bǔ)。該方法是當(dāng)探針保持完整時利用 Taq 酶( 5'→3'外切酶) 的活性淬滅基團(tuán)吸收發(fā)射的 熒光。當(dāng)有特異的而不是非特異的 PCR 發(fā)生時，Taq 酶同時發(fā)揮其 5'→3'外切酶活性，將與模板雜交的探 針切碎，報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，淬滅作用被解除， 熒光信號釋放，通過檢測系統(tǒng)就可以觀察到信號的變 化，熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成呈正相關(guān)。上海融享生物科技有限公司主做的qPCR。

在熒光定量 PCR 技術(shù)中，有一個很重要的概念—

—Ct 值。C 表示 Cycle（循環(huán)），t 表示 threshold(閾值)，

Ct 值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域

值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，

熒光域值(threshold)的設(shè)定：PCR 反應(yīng)的前 15 個

循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)

置是 3~15 個循環(huán)的熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍，即：

threshold = 10 ’SDcycle 6-15。

Ct 值與起始模板的關(guān)系：研究表明，每個模板的

Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始

拷貝數(shù)越多，Ct 值越小[5-6]。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)

準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)表示起始拷貝數(shù)的對

數(shù)，縱坐標(biāo)表示 Ct 值。因此，只要獲得未知樣品的 Ct

值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)

那么qPCR的優(yōu)勢都有哪些呢？上海SYBRGreen法qPCR哪里有

上海融享生物科技有限公司qPCR的上乘。上海SYBRGreen法qPCR哪里有

實時熒光定量 PCR 技術(shù)的分類：熒光探針法：水解探針法。水解探針的結(jié)構(gòu)特點是寡核苷酸序列

的 5′端為熒光報告基團(tuán)，3′端 為 熒 光 淬 滅 基 團(tuán)。PCR 擴(kuò) 增

前，探針游離于靶序列外，報告基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)

吸收，檢測不到熒光，但有時會因淬滅不徹底，會檢測到微

弱的熒光。在 PCR 退火時，探針特異性地結(jié)合到靶序列上，

在延伸階段，利用 Taq 酶 5′-3′外切酶的活性將探針?biāo)猓?

熒光報告基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)分離，熒光信號被釋放，并與

PCR 產(chǎn)物的數(shù)量成正相關(guān)。由于水解探針的作用機(jī)理依賴

于 Taq 酶 5′-3′外切酶的活性，所以水解探針又稱為 Taqman

探針。 上海SYBRGreen法qPCR哪里有