本申請(qǐng)涉及轉(zhuǎn)錄組基因測(cè)序領(lǐng)域,特別是涉及一種轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)的方法、試劑和應(yīng)用。背景技術(shù)::基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是生命科學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)性工作。由于絕大部分非模式生物缺乏基因組數(shù)據(jù),全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序就變得尤為重要,全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本可以促進(jìn)這些物種的基因功能、基因表達(dá)調(diào)控和進(jìn)化關(guān)系等多方面的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。當(dāng)前,絕大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)都是基于第二代高通量測(cè)序技術(shù)獲得的。然而,第二代測(cè)序技術(shù)測(cè)序序列短,短序列拼接無(wú)法提供大量的長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本并且丟失了可變剪接等重要信息,因而轉(zhuǎn)錄組的從頭測(cè)序開始采用pacbio第三代測(cè)序技術(shù)。在2013年pacbiorsii推出時(shí),其通量較低,測(cè)序成本一直讓科研人員望而止步。到2015年10月,pacbio推出sequel平臺(tái),大幅提升了全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序通量,在通量上是pacbiorsii的5-10倍。鑒于三代測(cè)序技術(shù)在科研甚至臨床領(lǐng)域的發(fā)展?jié)摿?,很多公司相繼引入sequel平臺(tái),提供pacbio三代測(cè)序的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)。目前pacbio三代測(cè)序的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組按照pacbio公司推出的標(biāo)準(zhǔn)方案來(lái)進(jìn)行,過程如圖1所示,主要包括兩個(gè)方面:cdna的制備和轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)。其中,cdna的制備包括使用clontech公司的smarterpcrcdnasynthesiskit試劑盒,將rna反轉(zhuǎn)錄生成cdna。全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)比較好的公司找融享生物。四川真核有參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)
一、數(shù)據(jù)分析流程二、數(shù)據(jù)分析內(nèi)容1.數(shù)據(jù)預(yù)處理目的:對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行一定程度的過濾。原理:根據(jù)測(cè)序接頭以及測(cè)序質(zhì)量對(duì)原始的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,其中,測(cè)序質(zhì)量Q與測(cè)序錯(cuò)誤E之間的關(guān)系如下:結(jié)果:對(duì)預(yù)處理后質(zhì)量以及堿基分布統(tǒng)計(jì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì):將預(yù)處理后reads進(jìn)行拼接,得到拼接結(jié)果。原理:應(yīng)用deBruijngraphpath算法對(duì)reads進(jìn)行denovo拼接;對(duì)上一步的拼接結(jié)果,再用HamiltonPath算法拼接。結(jié)果:UniGene序列,UniGene統(tǒng)計(jì)信息,序列長(zhǎng)度分布圖3.數(shù)據(jù)庫(kù)注釋目的:對(duì)拼接得到的UniGene進(jìn)行功能注釋原理:通過blast+算法將拼接得到的UniGene序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)結(jié)果:比對(duì)結(jié)果表格,物種分布統(tǒng)計(jì)和Evalue分布統(tǒng)計(jì):UniGene定量分析。原理:以UniGene為reference,分別將每個(gè)樣本的reads進(jìn)行referencemapping,從而得到每個(gè)樣本在每個(gè)UniGenes中的一個(gè)reads覆蓋度,然后應(yīng)用RPKM/FPKM標(biāo)準(zhǔn)化公式對(duì)富集片段的數(shù)量進(jìn)行歸一化。RPKM:ReadsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads,公式下:FPKM:FragmentsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads,公式下:UniGene表達(dá)分布圖,1X,5X分別為FPKM=1,F(xiàn)PKM=5分界點(diǎn),可以大體觀察到低表達(dá)。貴州醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)原核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序找融享生物 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 SD位點(diǎn)分析、表達(dá)差異分析、功能富集等。
轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)飽和度模擬圖 注:橫坐標(biāo)為reads的采樣率,縱坐標(biāo)為RPKM的相對(duì)誤差,Q1-4分別展示了低表達(dá)到高表達(dá)的基因的飽和性: Q1 (0-25%):轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平排名位于前25%的基因;Q2 (25-50%): 轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平排名位于25-50%的基因;Q3 (50-75%): 轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平排名位于50-75%的基因;Q4 (75-100%): 轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平排名位于75%以上的基因.SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)是指在基因組上由單個(gè)核苷酸變異形成的遺傳標(biāo)記,其數(shù)量很多,多態(tài)性豐富?;诟鳂悠?reads 與參考基因組序列的比對(duì)結(jié)果
外顯子捕獲測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析有什么不同?外顯子捕獲測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序都是針對(duì)基因組上轉(zhuǎn)錄區(qū)域進(jìn)行測(cè)序,但是外顯子捕獲測(cè)序針對(duì)已有基因組信息的物種,而轉(zhuǎn)錄組分析既能針對(duì)已有基因組信息的物種,也能針對(duì)沒有基因組信息的新物種,因此,兩者的分析存在一定的差異:分析的目標(biāo)區(qū)域不同。外顯子捕獲測(cè)序只針對(duì)基因組上已知的編碼區(qū),而轉(zhuǎn)錄組測(cè)序不僅針對(duì)基因組上已知的編碼區(qū),還能夠檢測(cè)非編碼RNA等轉(zhuǎn)錄組的信息。得到的結(jié)果不同。外顯子捕獲測(cè)序可以得到序列變異的信息,而轉(zhuǎn)錄組測(cè)序不僅可以獲得已知序列的變異信息和新的轉(zhuǎn)錄本信息(針對(duì)從頭拼接),還可以得到表達(dá)譜信息和基因的可變剪接。外顯子捕獲測(cè)序的樣品來(lái)源是DNA,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的樣品來(lái)源是RNA。轉(zhuǎn)錄服務(wù)博士團(tuán)隊(duì)專門為您打造屬于您的服務(wù)。
轉(zhuǎn)錄組分析流程將下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾得到 Clean Data,與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì),得到的 Mapped Data,進(jìn)行插入片段的長(zhǎng)度檢驗(yàn)、隨機(jī)性檢驗(yàn)等文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估;進(jìn)行可變剪接分析、新基因發(fā)掘和基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化等結(jié)構(gòu)水平分析;根據(jù)基因在不同樣品或不同樣品組中的表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)分析、差異表達(dá)基因功能注釋和功能富集等表達(dá)水平分析。測(cè)序質(zhì)量控制在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析之前,首先需要確保這些Reads有足夠高的質(zhì)量,以保證后續(xù)分析的準(zhǔn)確。所以要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制,經(jīng)過一系列的質(zhì)量控制之后得到的高質(zhì)量的Clean Dat。。全基因組測(cè)序找上海融享生物科技有限公司。陜西BCR轉(zhuǎn)錄組測(cè)序哪家好
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